那么下面上海金鹏分析仪器有限公司为大家简单介绍一下关于掌握蛋白纯化中亲和层析和凝胶层析分离的一般原理和操作方法。

一、目的要求：

1. 学习与掌握亲和层析和凝胶层析分离的一般原理和操作方法。
2. 了解自动化纯化设备基本组成和原理。
3. 了解亲和吸附层析琼脂糖、凝胶过滤葡聚糖的基本性质。掌握组氨酸标签蛋白的基本性质和纯化原理和操作；掌握缓冲液置换和脱盐的原理和操作。

 

二、实验概述（如下图）

实验步骤：

1. 样品预处理：即通过超声这种细胞破碎的手段，将在大肠杆菌 E.coli 中表达的重组的带 6 个 His 标签的绿色荧光蛋白释放到相应的缓冲液当中，再通过离心，0.2 微米滤膜过滤等去除细胞碎片和别的污染物；
2. 组氨酸标签蛋白亲和层析：HisTrapTMHP crude, 1mL 预装层析柱，进行亲和层析，一步就可以达到 90% 左右的纯度
3. 凝胶过滤层析脱盐去除咪唑：HiTrapTM  Desalting 5mL 预装层析柱进行脱盐，置换缓冲液
4. 电泳：对纯化过的样品的检测。

三、设备以及试剂准备（试剂均使用化学纯以上）：

1. 仪器：核酸蛋白检测仪 HD 系列、自动部分收集器 BSZ\DBS 系列、恒流泵 HL 系列
2. 样品：EGFP 原液
3. 层析柱：HisTrap HP 1ml, 1 根；HiTrap Desalting 5ml，1 根
4. 层析缓冲液

 

名称	配方	体积
缓冲液 A 亲和结合缓冲液 脱盐平衡和洗脱缓冲液	25mM 磷酸盐缓冲液,150mM NaCl, 20mM 咪唑,pH7.4	250ml
缓冲液 B 亲和洗脱缓冲液	25mM 磷酸盐缓冲液,150mM NaCl, 500mM 咪唑,pH7.4	100ml
去离子水	灭菌脱气或负压脱气	500ml
层析柱保存缓冲液	20% 乙醇